荧光光谱

荧光光谱是指某些物质经某波长入射光照射后，分子从能级S_a被激发至能级S_b，并在很短时间内去激发从S_b返回S_a，发出波长长于入射光的荧光。

荧光光谱原理

设分子能级为基态S_a，激发态S_b。

分子在能级S_a和S_b上的分布按照波尔兹曼分布规律：

${\displaystyle n_{b}/n_{a}=e^{-(E_{b}-E_{a})}=e^{-h\nu /kT}}$ 

基态上分子数目变化速率为

${\displaystyle -{\frac {dn_{a}}{dt}}=I(\nu )n_{a}B_{ab}-I(\nu )n_{b}B_{ba}-n_{b}A_{ba}}$ 

平衡时（稳定态），上式为0： 又有：

迁移几率（爱因斯坦系数）

${\displaystyle B_{ab}=B_{ba}={\frac {2\pi }{3\hbar ^{2}}}D_{ab}}$ 

偶极强度

${\displaystyle D_{ab}=\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid }$ 

频率ν处的入射光强

${\displaystyle I(\nu )={\frac {8{\pi }h{\nu ^{3}}}{c^{3}(e^{h{\nu }/kT}-1)}}}$ 

推导出： S_b通过发射光子从回到S_a的几率，即衰减常数λ

${\displaystyle A_{ba}=({\frac {32{\pi ^{3}}{\nu ^{3}}}{3c^{3}\hbar }})\mid <\psi _{b}\mid {\underline {\mu }}\mid \psi _{a}>\mid }$ 

S_b上的分子去激发速率

${\displaystyle {\frac {dn_{b}}{dt}}=-A_{ba}n_{b}}$ 

上式的一个解为

${\displaystyle n_{b}(t)=n_{b}(0)e^{-A_{ba}t}}$ 

可见激发态上的分子数目以指数形式衰减，衰减常数为A_ba S_b的辐射寿命为（此处参考指数衰减）

${\displaystyle \tau _{R}={\frac {1}{A_{ba}}}}$ 

此仅当吸收的光子和随后发射的光子相同时候有效，即全部吸收的光能量通过辐射过程全部发出光子消耗掉。 而实测时激发态寿命很少和上述寿命一致，因为激发态除了直接发射光子外有很多其他途径失去能量。

S_b通过发出荧光回到S_a的过程的反应速率，即固有荧光速率常数 k_F

${\displaystyle k_{F}=A_{ba}={\frac {1}{\tau _{R}}}}$ 

S_b回到S_a的其他非辐射途径包括内转变，系统间转变，猝熄作用，其速率常数分别为k_IC,k_IS,k_Q[Q] 则S_b总的去激化（熄灭）常数为k_F+k_IC+k_IS+k_Q[Q]

荧光量子产率

${\displaystyle \phi _{F}={\frac {k_{F}}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}}}$ 

也可以写作发射光子数/吸收光子数，即发射的荧光光子数/入射光照射时的吸收量

因为大量的非辐射过程的存在，所以激发态实际衰减时间远小于理想的辐射寿命τ_R 描述此动力学过程

${\displaystyle -{\frac {d[S_{b}]}{dt}}=(k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q])[S_{b}]}$ 

此方程的一个解为

${\displaystyle S_{b}(t)=S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}}$ 

S_b是激发态上的分子数

斯托克斯位移

主条目：斯托克斯位移

吸收曲线的0,0跃迁与发射曲线的0,0跃迁不重合，之间有一位移，荧光光谱较相应的吸收光谱红移。 原因是分子在处于激发态期间进行了重定向/重排布，消耗了能量，故荧光光谱的0,0峰向低能量（高波长）方向平移。

荧光强度

${\displaystyle A=\epsilon cl=lg{\frac {I_{0}}{I}}}$ 

得到

${\displaystyle I=I_{0}e^{-2.303\epsilon cl}}$ 

观测发射强度为

${\displaystyle F(\lambda )=2.303\epsilon clI_{0}\phi _{F}f(\lambda )d=\epsilon \phi _{F}f(\lambda )cI_{0}k}$ 

k=2.303ld

给一束脉冲入射光后，发射光在脉冲后的时间t时的强度I(t)，与激发态的衰减率dS_b/dt及激发态通过荧光衰减的比率φ_F（量子产率）成比例：

${\displaystyle I(t)={\frac {dS_{b}}{dt}}\phi _{F}=S_{b}(0)({\frac {\phi _{F}}{\tau _{F}}}e^{-t/\tau _{F}}=k_{F}S_{b}(0)e^{-t/\tau _{F}}}$ 

随时间表现为指数衰减

系统内有一种荧光物质时：

${\displaystyle E_{m}(t)=Ae^{-t/\tau _{F}}}$ 

系统中有两种荧光物质时：

${\displaystyle E_{m}(t)=A_{1}e^{-t/\tau _{1F}}+A_{2}e^{-t/\tau _{2F}}}$ 

Em是荧光强度，上述公式为荧光衰减（decay）公式

内部滤光效应

对高浓度溶液而言，荧光的再吸收不能忽略。大部分入射光在系统前半部分被吸收，发射的荧光被再吸收，只有少量的荧光通过狭缝入射到荧光探测器上，使得探测到的荧光强度减少。

外环境影响

去激发同样可能由于碰撞或和溶剂分子的混合导致，以速率k_Q[Q]发生。和其他过程不同，考虑碰撞时此猝熄是一个双分子过程。 S_b + Q → S_a + Q (k_Q[Q])

因为Q通常浓度远大于S_b ，此过程被视为一个伪一级反应，k_Q[Q]的值可通过变化猝熄剂Q的浓度，观察对φ_F的影响测得。芳香类发色基的辐射寿命通常为1*10^-9到100*10^-9秒。因此，相比较而言，猝熄过程是相当有效率的。普遍的猝熄剂如O₂和I^-离子，每和激发态分子碰撞一次就会使其去激发一次。此反应速率仅被扩散限制。在微摩尔浓度猝熄剂下，碰撞发生速率为10⁸每秒，因此可以观察到明显的猝熄。

${\displaystyle {\frac {F_{0}}{F}}={\frac {\phi _{0}}{\phi }}={\frac {k_{F}+k_{I}C+k_{I}S+k_{Q}[Q]}{k_{F}+k_{I}C+k_{I}S}}=1+k_{Q}[Q]}$ 

τ₀可测，以F₀/F对[Q]作图求得k_Q

荧光共振能量迁移

简称FRET，此过程适用与计算两端带发色基的高分子长度。

存在供体D和受体A，当光入射时，激发基态供体Da→Db，Db又去激发，通过共振将能量传递给Aa，使得Aa→Ab。

定义迁移效率（E）是Db去激发传递能量到Aa占总Db去激发的比例

${\displaystyle E={\frac {k_{T}}{k_{T}+k_{F}^{D}<+k_{I}C^{D}<+k_{I}S^{D}}}}$ 

通过一系列复杂的计算和变化，此处省略，得：

${\displaystyle k_{T}={\frac {1}{\tau _{0}}}{\frac {R_{0}}{R}}}$ 

${\displaystyle R_{0}=9.7*10^{3}(J\kappa ^{2}n^{-4}\phi _{D})^{\frac {1}{6}}cm}$ 

${\displaystyle J=\int \epsilon (\nu )f_{D}(\nu )\nu ^{-4}\,d\nu }$ 

推导出：

${\displaystyle E={\frac {R_{0}^{6}}{R_{0}^{6}+R^{6}}}}$ 

这里R₀对一个固定的化学系统而言是常数，R是供体和受体之间的距离，R越接近R₀，测计算越精确。

此外计算E的方法有：

${\displaystyle {\frac {\phi _{D+A}}{\phi _{D}}}=1-E}$ 

${\displaystyle {\frac {F_{D+A}}{F_{A}}}=1+{\frac {\epsilon _{D}c_{D}}{\epsilon _{A}c_{A}}}E}$ 

${\displaystyle {\frac {\tau _{D,A}}{\tau _{D}}}=1-E}$ 

参考文献

• C.P Cantor & P.R. Schimmel, BIOPHYSICAL CHEMISTRY, Part II. Techniques for the study of biological structure and function. Page 433-465.