在第1和35段还要有Soprano in ripieno（合奏女高音）。演出传统上还会有儿童合唱团（作为两个合唱团中女声的对照），这还和巴赫当时的情况有关，当时在教堂只能动用童声女高音（就是说男性假声唱女高音和女中音）。在其中一个版本中，这部分的声音甚至为管风琴所代替。受難曲描述耶穌被釘在十字架受難的宗教音樂，馬太受難曲則是以聖經「馬太福音」第26、27章為歌詞的大型作品，共有「最後的晚餐」、「耶穌之死」共 68 首曲子所組成，總共寫了三年之久。而演出時須有二個管弦樂團、數位演唱者與一個少年合唱團，加上管風琴伴奏，演奏全曲需要約三小時[2]。
作品的特殊編制來自於首演地點圣多马教堂位於聖壇兩側的兩架管風琴與詩班席，两个合唱团和管弦乐队产生出非常特殊的音响效果，两个合唱团会进行对话，扮演不同的角色，或是唱出作為省思的評論。值得一提的是开头和结尾两个大合唱。作品中有大量的长而深沉的咏叹调，表现了耶稣的受难。全曲共分六段劇情，以五首聖詠（Chorale）分隔。其中採用哈斯勒（Hans Leo Hassler, 1564–1612）於1604年所寫的德國情歌旋律，由巴赫加上和聲的聖詠 O Haupt voll Blut und Wunden，被稱為「受難聖詠」（Passion Chorale），以不同的調性與歌詞一共出現五次，是全曲的核心。這五首聖詠分別是：
No. 15：Erkenne mich, mein Hüter
No. 17：Ich will hier bei dir stehen
No. 44：Befiehl du deine Wege
No. 54：O Haupt voll Blut und Wunden
No. 62：Wenn ich einmal soll scheiden
受難聖詠不但出現在聖難曲中，巴赫亦在其他作品當中使用，包括「聖誕神劇」也有使用到受難聖詠。
在马太受难曲中，巴赫使用了許多音樂象徵手法。例如耶稣的宣敘調有弦樂伴奏，被稱為「光環」。而其他人则只有低音提琴伴奏。在耶穌被釘上十字架之後大喊「Eli, Eli, lama asabthani?」（我的神，我的神，為什麼離棄我？）時，是全曲當中耶穌角色唯一沒有光環的段落（No. 61a）。
根據巴赫學者Joshua Rifkin於1975年發表於《The Musical Quarterly》的「The Chronology of Bach's Saint Matthew Passion」，馬太受難曲應首演於1727年的受難日（Good Friday，1727/4/11），地點在圣多马教堂。第二次演出是兩年後的1729年的受難日（1729/4/25）。巴赫曾對馬太受難曲做過幾次改版，目前可聽到的演出是以1736年的修訂版為主。
