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核糖核酸测序

核糖核酸测序,简称RNA测序(英語:RNA Sequencing,英文简称RNA-Seq,也被称为全转录物组散彈枪法测序 Whole Transcriptome Shotgun Sequencing[1],简称WTSS)是基于第二代测序技术的转录组学研究方法。RNA测序是使用第二代测序的能力,在给定时刻从一个基因组中,揭示RNA的存在和数量的一个快照的技术。[2]

首先提取生物样品的全部转录的RNA,然后反转录为c-DNA后进行的二代高通量测序,在此基础上进行片段的重叠组装,从而可得到一个个的转录本。进而可以形成对该生物样品当前发育状态的基因表达状况的全局了解(global)。进一步说,若和下一阶段的生物样品的RNA-Seq转录组进行比较,则可以得到全部的(在转录层面)基因表达的上调及下调--这就形成了表达谱,针对关键基因则可以形成你要想要的通路(英語:pathway)的构建。

介绍 编辑

相较于一个静态的染色体而言,细胞内的转录物组是一个处于不断变化的动态过程。随着现在的次世代基因测序(NGS)技术的发展,使得可测得的DNA碱基覆盖面增加且样本输出的吞吐量增大。有助于对细胞内RNA转录物进行测序,提供包括选择性剪接的转录、转录后的修饰、基因融合、突变/SNPs以及基因表达量改变等细节[3]。,RNA测序不仅能检测mRNA的转录,还能观测到包括总RNA和小RNA(miRNA、tRNA和核糖体RNA)在内不同尺度的RNA表达谱[4]。RNA测序还能用来确定外显子/内含子的边界,修正之前注释的5'和3'端基因边界。未来的RNA测序研究还包括观察感染时细胞传导路径的变化[5]和癌症中不同基因表达程度[6]。下一代基因测序之前,对转录物组学和基因表达的研究主要基于基因表达芯片(微阵列),后者包含数以千计用于探测靶向序列的DNA探针,可以得到所有表达出转录物的表达谱。基因表达芯片之后,基因表达的系列分析英语Serial analysis of gene expression(SAGE)是主要的基因分析技术。

相对于RNA测序,基因表达芯片(微阵列)测序结果的覆盖面很窄,只能覆盖染色体中1千多万SNP中的常见等位基因的SNP(50万到200万)。因此,现有数据库中一般没有罕见等位基因的测序结果,而只有常见的SNP的数据,这对研究者来说是一个重大缺陷。很多癌症源于突变概率小于1%的突变,因而很难被检测出。但是,基因表达芯片(微阵列)测序在已知的等位基因检测中仍很重要,使它们非常适合监管机构批准的诊断,如囊性纤维化。


分析 编辑

 
Diagram outlining the RNASeq analyses described in this section

轉錄體組裝 编辑

有兩種方法用於將原始序列讀數分配給基因體特徵(即組裝轉錄體):

  • De novo: 這種方法不需要參考基因體來重建轉錄體,通常基因體未知、不完整或與參考基因體相比有顯著不同時使用[7]。短讀長序列進行de novo組裝時的挑戰包括:(1) 確定哪些序列應連接成連續序列(重疊序列群, contigs)(2) 定序錯誤和其他人為的穩定性 (3) 計算效率。使用在de novo組裝的主要演算法是從重疊圖轉換而來,稱為de Bruijn圖,其將序列讀長切分為長度k的序列並將所有k-mer轉存成雜湊表[8]。使用de Bruijn圖做組裝的工具有 Velvet[9]、Trinity[7]、Oases[10] 和 Bridger[11]。同一樣品的雙端序列和長序列讀長可作為模板或骨架來彌補短讀長序列的缺陷。評估de novo組裝品質的指標包括重疊序列群長度的中位數、重疊序列群數量和 N50英语N50, L50, and related statistics[12]
 
RNA-seq mapping of short reads in exon-exon junctions. The final mRNA is sequenced, which is missing the intronic sections of the pre-mRNA.
  • 引導式組裝:這種方法使用與DNA比對相同的方式,比對序列至參考基因體的非連續部分則需要額外的計算複雜度[13]。這些非連續序列讀數是對剪接產物進行定序的結果(如圖)。通常比對演算法分為兩個步驟:(1) 對齊序列較短的部分 (seed) (2) 使用 动态规划 來找到最佳比對,有時結合已知的註釋。使用基因體引導比對的工具包括 Bowtie[14] TopHat(基於Bowtie結果對齊剪接點)[15][16]、Subread[17]、STAR[13]、HISAT2[18]、Sailfish[19]、Kallisto[20] 和 GMAP[21]。基因體引導式組裝的品質可以藉由以下兩者來測量:(1) de novo組裝指標(如N50)2)使用精確度、召回率或它們的組合(如F1 score)(與已知的轉錄本、剪接點、基因體和蛋白質序列比較)[12]。此外,可以使用模擬序列讀數的方式進行電腦模擬評估[22][23]


参考文献 编辑

  1. ^ Ryan D. Morin, Matthew Bainbridge, Anthony Fejes, Martin Hirst, Martin Krzywinski, Trevor J. Pugh, Helen McDonald, Richard Varhol, Steven J.M. Jones, and Marco A. Marra. . BioTechniques. 2008, 45 (1): 81–94 [2014-02-16]. PMID 18611170. doi:10.2144/000112900. (原始内容存档于2009-03-21). 
  2. ^ Chu Y, Corey DR. RNA sequencing: platform selection, experimental design, and data interpretation. Nucleic Acid Ther. August 2012, 22 (4): 271–4. PMC 3426205 . PMID 22830413. doi:10.1089/nat.2012.0367. 
  3. ^ Maher CA, Kumar-Sinha C, Cao X; et al. Transcriptome sequencing to detect gene fusions in cancer. Nature. March 2009, 458 (7234): 97–101. PMC 2725402 . PMID 19136943. doi:10.1038/nature07638. 
  4. ^ Ingolia NT, Brar GA, Rouskin S, McGeachy AM, Weissman JS. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. August 2012, 7 (8): 1534–50. PMC 3535016 . PMID 22836135. doi:10.1038/nprot.2012.086. 
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外部链接 编辑

  • (英文)RNA-Seq for Everyone (页面存档备份,存于互联网档案馆): a high-level guide to designing and implementing an RNA-Seq experiment.
  • (英文)ChIPBase database: 提供的蛋白质编码基因的表现谱和长链非编码RNA(lncRNAs) (lincRNAs) 从22个组织的RNA测序的数据。
  • Martin A. Perdacher (September 2011) Next-Generation Sequencing and its Applications in RNA-Seq[永久失效連結]. Theory part of the Bachelorthesis, Hagenberg. (英文)

核糖核酸测序, 此條目需要精通或熟悉生命科学的编者参与及协助编辑, 2012年2月21日, 請邀請適合的人士改善本条目, 更多的細節與詳情請參见討論頁, 另見其他需要生命科学專家關注的頁面, 简称rna测序, 英語, sequencing, 英文简称rna, 也被称为全转录物组散彈枪法测序, whole, transcriptome, shotgun, sequencing, 简称wtss, 是基于第二代测序技术的转录组学研究方法, rna测序是使用第二代测序的能力, 在给定时刻从一个基因组中, 揭示rna的存在和. 此條目需要精通或熟悉生命科学的编者参与及协助编辑 2012年2月21日 請邀請適合的人士改善本条目 更多的細節與詳情請參见討論頁 另見其他需要生命科学專家關注的頁面 核糖核酸测序 简称RNA测序 英語 RNA Sequencing 英文简称RNA Seq 也被称为全转录物组散彈枪法测序 Whole Transcriptome Shotgun Sequencing 1 简称WTSS 是基于第二代测序技术的转录组学研究方法 RNA测序是使用第二代测序的能力 在给定时刻从一个基因组中 揭示RNA的存在和数量的一个快照的技术 2 首先提取生物样品的全部转录的RNA 然后反转录为c DNA后进行的二代高通量测序 在此基础上进行片段的重叠组装 从而可得到一个个的转录本 进而可以形成对该生物样品当前发育状态的基因表达状况的全局了解 global 进一步说 若和下一阶段的生物样品的RNA Seq转录组进行比较 则可以得到全部的 在转录层面 基因表达的上调及下调 这就形成了表达谱 针对关键基因则可以形成你要想要的通路 英語 pathway 的构建 目录 1 介绍 2 分析 2 1 轉錄體組裝 3 参考文献 4 外部链接介绍 编辑相较于一个静态的染色体而言 细胞内的转录物组是一个处于不断变化的动态过程 随着现在的次世代基因测序 NGS 技术的发展 使得可测得的DNA碱基覆盖面增加且样本输出的吞吐量增大 有助于对细胞内RNA转录物进行测序 提供包括选择性剪接的转录 转录后的修饰 基因融合 突变 SNPs以及基因表达量改变等细节 3 RNA测序不仅能检测mRNA的转录 还能观测到包括总RNA和小RNA miRNA tRNA和核糖体RNA 在内不同尺度的RNA表达谱 4 RNA测序还能用来确定外显子 内含子的边界 修正之前注释的5 和3 端基因边界 未来的RNA测序研究还包括观察感染时细胞传导路径的变化 5 和癌症中不同基因表达程度 6 下一代基因测序之前 对转录物组学和基因表达的研究主要基于基因表达芯片 微阵列 后者包含数以千计用于探测靶向序列的DNA探针 可以得到所有表达出转录物的表达谱 基因表达芯片之后 基因表达的系列分析 英语 Serial analysis of gene expression SAGE 是主要的基因分析技术 相对于RNA测序 基因表达芯片 微阵列 测序结果的覆盖面很窄 只能覆盖染色体中1千多万SNP中的常见等位基因的SNP 50万到200万 因此 现有数据库中一般没有罕见等位基因的测序结果 而只有常见的SNP的数据 这对研究者来说是一个重大缺陷 很多癌症源于突变概率小于1 的突变 因而很难被检测出 但是 基因表达芯片 微阵列 测序在已知的等位基因检测中仍很重要 使它们非常适合监管机构批准的诊断 如囊性纤维化 分析 编辑参见 List of RNA Seq bioinformatics tools 英语 List of RNA Seq bioinformatics tools nbsp Diagram outlining the RNASeq analyses described in this section轉錄體組裝 编辑 参见 Sequence alignment software Short Read Sequence Alignment 英语 Sequence alignment software 有兩種方法用於將原始序列讀數分配給基因體特徵 即組裝轉錄體 De novo 這種方法不需要參考基因體來重建轉錄體 通常基因體未知 不完整或與參考基因體相比有顯著不同時使用 7 短讀長序列進行de novo組裝時的挑戰包括 1 確定哪些序列應連接成連續序列 重疊序列群 contigs 2 定序錯誤和其他人為的穩定性 3 計算效率 使用在de novo組裝的主要演算法是從重疊圖轉換而來 稱為de Bruijn圖 其將序列讀長切分為長度k的序列並將所有k mer轉存成雜湊表 8 使用de Bruijn圖做組裝的工具有 Velvet 9 Trinity 7 Oases 10 和 Bridger 11 同一樣品的雙端序列和長序列讀長可作為模板或骨架來彌補短讀長序列的缺陷 評估de novo組裝品質的指標包括重疊序列群長度的中位數 重疊序列群數量和 N50 英语 N50 L50 and related statistics 12 nbsp RNA seq mapping of short reads in exon exon junctions The final mRNA is sequenced which is missing the intronic sections of the pre mRNA 引導式組裝 這種方法使用與DNA比對相同的方式 比對序列至參考基因體的非連續部分則需要額外的計算複雜度 13 這些非連續序列讀數是對剪接產物進行定序的結果 如圖 通常比對演算法分為兩個步驟 1 對齊序列較短的部分 seed 2 使用 动态规划 來找到最佳比對 有時結合已知的註釋 使用基因體引導比對的工具包括 Bowtie 14 TopHat 基於Bowtie結果對齊剪接點 15 16 Subread 17 STAR 13 HISAT2 18 Sailfish 19 Kallisto 20 和 GMAP 21 基因體引導式組裝的品質可以藉由以下兩者來測量 1 de novo組裝指標 如N50 2 使用精確度 召回率或它們的組合 如F1 score 與已知的轉錄本 剪接點 基因體和蛋白質序列比較 12 此外 可以使用模擬序列讀數的方式進行電腦模擬評估 22 23 参考文献 编辑 Ryan D Morin Matthew Bainbridge Anthony Fejes Martin Hirst Martin Krzywinski Trevor J Pugh Helen McDonald Richard Varhol Steven J M Jones and Marco A Marra Profiling the HeLa S3 transcriptome using randomly primed cDNA and massively parallel short read sequencing BioTechniques 2008 45 1 81 94 2014 02 16 PMID 18611170 doi 10 2144 000112900 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transcriptome using RNA Seq Cancer Prev Res Phila June 2011 4 6 803 17 PMC 3694393 nbsp PMID 21636547 doi 10 1158 1940 6207 CAPR 11 0212 引文格式1维护 显式使用等标签 link 7 0 7 1 Grabherr MG Haas BJ Yassour M Levin JZ Thompson DA Amit I Adiconis X Fan L Raychowdhury R Zeng Q Chen Z Mauceli E Hacohen N Gnirke A Rhind N di Palma F Birren BW Nusbaum C Lindblad Toh K Friedman N Regev A Full length transcriptome assembly from RNA Seq data without a reference genome Nature Biotechnology May 2011 29 7 644 52 PMC 3571712 nbsp PMID 21572440 doi 10 1038 nbt 1883 De Novo Assembly Using Illumina Reads PDF 22 October 2016 原始内容存档 PDF 于2020 09 24 Zerbino DR Birney E Velvet algorithms for de novo short read assembly using de Bruijn graphs Genome Research May 2008 18 5 821 9 PMC 2336801 nbsp PMID 18349386 doi 10 1101 gr 074492 107 Oases a transcriptome assembler for very short reads 2019 02 16 原始内容存档于2018 11 29 Chang Z Li G Liu J Zhang Y Ashby C Liu D Cramer CL Huang X Bridger a new framework for de novo 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Sequencing and its Applications in RNA Seq 永久失效連結 Theory part of the Bachelorthesis Hagenberg 英文 取自 https zh wikipedia org w index php title 核糖核酸测序 amp oldid 78985163, 维基百科,wiki,书籍,书籍,图书馆,

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